肿瘤免疫治疗（如免疫检查点阻断ICB、提取淋巴细胞处理后回输的过继性T细胞治疗ACT和嵌合抗原受体CAR治疗）都依赖于强效的抗肿瘤T细胞对癌细胞的特异性杀伤【1】。使用肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的过继T细胞治疗（tumor infiltrating lymphocyte adoptive T-cell transfer，TIL-ACT）和ICB的研究表明，抗肿瘤反应是通过T细胞识别人类白细胞抗原（HLA）分子上呈现的突变新生抗原来靶向癌细胞【2-3】。在多个II期临床试验中，TIL-ACT已被证明能够介导某些转移性黑色素瘤患者以及传统上被认为是弱免疫原性的上皮癌患者体内的完全持久反应【3-4】。
影响免疫治疗的肿瘤内在因素，主要包括肿瘤突变、新生抗原、HLA类型和表达、DNA损伤修复能力和程序性死亡配体-1（PD-L1）蛋白的表达【1】。最近的研究发现ICB反应也与T细胞内在因素（TCF7、CD39和TIM3的表达）有关【5】，但关于肿瘤反应性的TIL亚群是否直接负责免疫治疗（包括TIL-ACT）目前还不清楚。虽然T细胞分化对ACT的影响已经在小鼠中有所研究，但是否与人类癌症反应相关的肿瘤反应性TIL相适应还不清楚。
近日，美国国立卫生研究院国家癌症研究癌症研究中心Steven Rosenberg和Paul Robbins团队合作，在Science上发表了题为“Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer”的研究论文，描述了两种不同的亚群：介导ACT反应的TIL亚群和抗肿瘤反应性的TIL亚群。
研究者比较了对TIL-ACT治疗有完全反应的患者（CRs，n=24）和无反应的患者（NRs，n=30）的TILs的表型差异，这些TILs来自于同一组患者，这些患者为IV期转移性黑色素瘤，并接受了未根据肿瘤反应性选择的自体体外扩增TILs治疗。通过质谱细胞仪对来自7个CRs和9个NRs的480万个TILs进行单细胞分析，发现了34个细胞表面标志物的表达具有异质性，其中CD44、CD27、CD28高表达、CD39、CD69、TIM3低表达的CD8+ T细胞在CR中比NR中丰度高4倍。基于临床结果的机器学习表明CD69和CD39最具有临床相关特征。通过多参数流式细胞术对一组独立的38个TILs（CRs n = 17，NRs n = 21）进行评估，发现CD8+CD39-CD69- TIL亚群在CR 中比NR中比例高2.5倍，细胞数高4倍，证实了该亚群与ACT反应之间的相关性。虽然CD8+CD39+CD69+（DP）不显著影响黑色素瘤特异性生存率和无进展生存率，但较多的CD8+CD39-CD69-（DN）细胞可以显著提高无进展生存率。进一步分析DP TIL和DN TIL亚群的表型，发现DP TIL高表达效应因子和耗竭相关转录因子TOX，而DN TIL低表达PD-1、TIM3，高表达CD62L、CD27、SLAMF6、TCF7。虽然DN TIL转录谱与外周血干细胞记忆相似，但缺乏相关的常规CD95和CCR7的表达。体外刺激实验发现DN TILs可以进行自我更新，并分化出SP和DP亚群，DP TILs则一直保持DP状态。此外，ATAC-seq发现DN TILs开放染色质区富集了KLF4、TCF7、LEF7等结合位点，DP TILs则富集了FOSL1、FOS、JUNB、JUND等结合位点。并通过分析此前黑色素瘤ICB反应治疗前和治疗后的研究，得到了相同的结论，即ACT/ICB反应相关的DN TILs具有祖先记忆干细胞特征，而DP TILs则处于终末分化状态。接下来研究人员利用串联迷你基因新生抗原筛选平台，从输注的的TILs定义了26个HLA I类限制性新生抗原，通过HLA-新生抗原四聚体+TILs可以检测到由CD39和CD69表达定义的 TIL亚群，主要存在于CD39+CD69+终末分化状态，与此前的研究新生抗原特异性的T细胞CD39富集情况一致。但按ACT的反应状态分析，CR输注的新生抗原特异性的TILs DN细胞比例较高。该结果表明在CRs中，有一个肿瘤新生抗原反应性TILs亚群以CD39-干细胞样状态存在，肿瘤反应性新生抗原特异性TILs在分化亚群中的富集也不一定对应于它们在干细胞样状态下的比例。为了确定新生抗原反应性TCRs和相关特征，研究人员对一个CR和一个NR的输注TILs进行了联合scRNA和scTCR测序，发现CR患者的免疫主导的SRPX突变特异性新生抗原特异性TCR（NeoTCRs）（SRPXmut）在DN中富集，而其他NeoTCRs在DN和DP群中的频率则具有可变性。对SRPXmut NeoTCR+单细胞的进一步分析发现，这些克隆型中的10个中有9个（所有NeoTCR克隆型中的20个中有15个）表现出阳性表型适应性。TCR测序结果也显示大多数NeoTCR克隆型（20个中的18个）持续时间长达75个月，这与TIL从祖干细胞样状态扩增的观点一致。而NR的测序结果显示NeoTCR+细胞主要富集在终末分化的细胞亚群，且两种输注的NeoTCR克隆型在治疗后的外周血中迅速下降，没有持久性。该结果表明，治疗反应可能和TCR持久性有关。最后，研究人员分别在体外和体内测试了CD39-CD69-肿瘤反应性的TIL治疗是否能很好的控制肿瘤，肿瘤反应性干细胞样DN亚群的体外扩增速度比DP亚群高1000倍，且保留了特异性。此外，与DP T细胞相比，体内DN T细胞的治疗也以剂量依赖的方式使移植黑色素瘤的小鼠肿瘤显著消退，也大大提高了小鼠生存率。总的来说，本研究发现了一种与癌症完全消退和TIL持续存在相关的记忆祖细胞（CD39-CD69-）干细胞样状态和一种与TIL持续存在性负相关的终末分化状态（CD39+CD69+）。且ACT反应性细胞也保留了干细胞样新生抗原特异性TIL的细胞池。重要的是，肿瘤反应性干细胞样TILs能够在体内进行自我更新、扩增，具有持久性和良好的抗肿瘤反应。https://science.sciencemag.org/content/370/6522/13281. A. Snyder et al., N. Engl. J. Med. 371,2189–2199 (2014).2. M. R. Parkhurst et al., Cancer Discov. 9,1022–1035 (2019).3. E. Tran, P. F. Robbins, S. A. Rosenberg, Nat.Immunol. 18, 255–262 (2017).4. E. Tran et al., Science 344, 641–645 (2014).5. M. Sade-Feldman et al., Cell 176, 404 (2019).
